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什么是PCR擴(kuò)增儀技術(shù)?
點(diǎn)擊次數(shù):2456 更新時(shí)間:2017-10-23
   什么是PCR擴(kuò)增儀技術(shù)?
  什么是PCR技術(shù)?是一種在體外擴(kuò)增核酸的技術(shù)。PCR的基本反應(yīng)包括以DNA為模板的反應(yīng)和以mRNA為模板的反應(yīng)。PCR技術(shù)是模擬體內(nèi)天然DNA(脫氧核糖核酸)的復(fù)制過(guò)程。以擴(kuò)增DNA為例,其基本原理是在模板、引物、4種dNTP和耐熱DNA聚合酶存在的條件下,特異擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段的酶促合成反應(yīng)。
  PCR擴(kuò)增儀的工作原理:
  PCR反應(yīng)一般設(shè)置20~40次循環(huán),每一循環(huán)包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三步反應(yīng)。每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個(gè)循環(huán)的模板。PCR的擴(kuò)增效率很高,如果循環(huán)次數(shù)是30次,那么新生DNA片段理論上達(dá)到230拷貝(約為109個(gè)分子)。
  PCR反應(yīng)每個(gè)循環(huán)的三個(gè)基本反應(yīng)步驟如下:
  ①模板DNA的變性:模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA產(chǎn)物解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備;
 ?、谀0錎NA與引物的退火(復(fù)性):模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合;
 ?、垡锏难由欤簻囟壬?2℃左右,DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應(yīng)原料,靶序列為模板,按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程,就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2~4分鐘,2~3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。PCR技術(shù)的特異性取決于引物與模板結(jié)合的特異性。
  PCR擴(kuò)增儀是利用PCR技術(shù)對(duì)特定基因做體外的大量合成,用于以檢測(cè)DNA/RNA為目的的各種基因分析。
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